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Synthesis of O-serogroup specific positive controls and real-time PCR standards for nine clinically relevant non-O157 STECs

Conrad, C.C., Gilroyed, B.H., McAllister, T.A., et Reuter, T.R. (2012). « Synthesis of O-serogroup specific positive controls and real-time PCR standards for nine clinically relevant non-O157 STECs. », Journal of Microbiological Methods, 91(1), p. 52-56. doi : 10.1016/j.mimet.2012.07.007  Accès au texte intégral (en anglais seulement)

Résumé

On reconnaît maintenant de plus en plus la pathogénicité chez l’humain des souches d’Escherichia coli productrices de shiga‑toxines (STEC) non‑O157, mais il n’existe aucune méthode normalisée pour les identifier. L’analyse des séquences a révélé qu’il était possible de classer les STEC en différents sérotypes O en fonction des régions variables de l’antigène O. L’amplification en chaîne par polymérase est une technique puissante permettant le criblage exhaustif et le diagnostic complexe de ces agents pathogènes, mais elle requiert l’utilisation d’un témoin positif servant à vérifier l’amplification qualitative et/ou quantitative des fragments d’ADN. Compte tenu de la nature pathogène des STEC, les témoins ne sont pas facilement accessibles et la culture cellulaire des souches de STEC de référence exige des conditions de biosécurité de niveau 2 ou plus. Pour contourner cette difficulté, des témoins de fragments d’ADN empilés spécifiques du type O codant les sites de reconnaissance des amorces ont été mis au point pour le criblage de neuf sérotypes de STEC fréquemment associés à des infections chez l’humain. Les témoins synthétiques ont été amplifiés par PCR, clonés dans un vecteur plasmidique et transférés dans des cellules bactériennes hôtes. Les plasmides amplifiés par l’expression bactérienne ont été purifiés, dilués en série et analysés comme des étalons pour la PCR en temps réel au moyen du SYBR Green et d’essais TaqMan. L’utilité des témoins synthétiques d’ADN a été démontrée dans les essais PCR classiques et en temps réel, et ces témoins ont été validés avec de l’ADN de souches naturelles de STEC.

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