Design, Construction, and Validation of Artificial MicroRNA Vectors Using Agrobacterium-Mediated Transient Expression System.

Bhagwat, B., Chi, M., Han, D., Tang, H., Tang, G., et Xiang, Y. (2016). « Design, Construction, and Validation of Artificial MicroRNA Vectors Using Agrobacterium-Mediated Transient Expression System. », Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 1405, p. 149-162. doi : 10.1007/978-1-4939-3393-8_14  Accès au texte intégral (en anglais seulement)

Résumé

La technologie des micro-ARN (miARN) artificiels utilise la voie de biogenèse des miARN pour produire de petits ARN sélectionnés de manière artificielle à partir de la structure de base des gènes codant des miARN. Il s’agit d’une stratégie simple pour induire la perte de fonction d’un gène qui a été utilisée dans des études de génomique fonctionnelle, d’amélioration de la qualité des cultures et de la résistance des plantes aux maladies virales. Mais une des grandes difficultés de l’utilisation des miARN artificiels est l’imprévisibilité de l’efficacité du silençage induit par les constructions et le fait qu’elles ne sont pas nécessairement exprimées de manière efficace dans les cellules végétales. Comme d’autres, nous avons trouvé qu’on pouvait obtenir une efficacité et une spécificité de silençage élevées en concevant des miARN artificiels parfaitement ou presque parfaitement complémentaires à leur cible. De plus, nous avons récemment montré que le système d’expression transitoire modulé par Agrobacterium peut servir à valider les constructions de miARN artificiels, et qu’il s’agit d’une méthode simple, rapide et efficace pour sélectionner des miARN artificiels hautement exprimables pour des transformations génétiques stables. Nous décrivons ici comment 1) concevoir des miARN artificiels avec une séquence parfaitement ou presque parfaitement complémentaire à celle du gène cible ou des groupes de gènes cibles; 2) incorporer des miARN artificiels potentiels dans la structure de base du gène miR168a avec une amplification par PCR inverse en une seule étape; 3) construire des vecteurs d’expression de miARN artificiels chez les plantes; et vérifier l’expression transitoire des miARN artificiels par agro-infiltration chez Nicotiana benthamiana; 4) extraire de petits ARN; et 5) analyser les miARN artificiels par transfert de Northern.

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