Increased sensitivity of Potato virus Y detection by RT-PCR using the RNA isolated with a process of differential centrifugation.

Zhang, J.H., Nie, X., Boquel, S., Al-Daoud, F., et Pelletier, Y. (2015). « Increased sensitivity of Potato virus Y detection by RT-PCR using the RNA isolated with a process of differential centrifugation. », Journal of Virological Methods. doi : 10.1016/j.jviromet.2015.07.008  Accès au texte intégral (en anglais seulement)

Résumé

De nombreux facteurs ont une incidence sur la sensibilité de la technique de transcription inverse suivie de la réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR) pour la détection de virus, notamment la spécificité des amorces et la qualité des matrices. Ces facteurs ont un effet particulièrement important sur les taux de détection dans les cas où les concentrations de virus sont faibles. En outre, l’ARN total qui a été isolé de plants de pommes de terre infectés par le virus Y de la pomme de terre (PVY) au moyen de la méthode d’isolement de l’ARN au sulfite de sodium ou de la mini-trousse RNeasy Plant renferme une proportion élevée de l’ARN de l’hôte et peut contenir des traces de résidus de composés phénoliques et de polysaccharides, ce qui peut inhiber la RT-PCR. La présente étude visait à améliorer la sensibilité de la détection du PVY en réduisant les quantités d’ARN de l’hôte dans les extraits analysés, par centrifugation différentielle suivie d’une extraction réalisée au moyen d’une mini-trousse RNeasy (méthode DCR). La trousse de RT-PCR One-step était relativement peu efficace pour l’amplification de l’ARN du PVY dans les cas où l’échantillon renfermait une proportion élevée d’ARN de la plante hôte. L’épreuve de RT-PCR en temps réel SYBR Green a révélé que les valeurs de cycle seuil (Ct, pour Cycle Threshold) pour le facteur d’élongation 1-α ARNm (Ef1α) de la pomme de terre étaient plus élevées dans le cas de l’ARN isolé au moyen de la méthode DCR que dans celui de l’ARN extrait au moyen de la mini-trousse RNeasy Plant, ce qui indique que la méthode DCR a permis une diminution significative de la proportion d’ARN de pomme de terre dans l’extrait. La quantité détectable d’ARN extrait de la sève de 10 folioles de pomme de terre infectées par le PVY et exemptes de PVY (rapport du poids frais de 1,5 : 100) était de < 0,001 ng avec la méthode DCR, alors qu’elle était de 0,01 avec la mini-trousse RNeasy Plant et de 0,02 ng avec la méthode d’isolement au sulfite de sodium.

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