A multiplex qPCR assay for detection and quantification of Plasmodiophora brassicae in soil.

Deora, A.D., Gossen, B.D., Amirsadeghi, S., et McDonald, M.R. (2015). « A multiplex qPCR assay for detection and quantification of Plasmodiophora brassicae in soil. », Plant Disease, 99(7), p. 1002-1009. doi : 10.1094/PDIS-06-14-0608-RE  Accès au texte intégral (en anglais seulement)

Résumé

Différents facteurs physiques et chimiques du sol peuvent empêcher la détection et la quantification de phytopathogènes terricoles par la qPCR. Nous avons mis au point une épreuve de qPCR TaqMan comprenant un témoin interne d’amplification pour identifier des spores dormantes de Plasmodiophora brassicae dans le sol et, le cas échéant, compenser le blocage de la quantification. Pour construire le témoin interne d’amplification, nous avons modifié une séquence codant la protéine fluorescente verte de manière à ce qu’elle puisse être amplifiée avec les amorces spécifiques du P. brassicae. L’ajout de 5 fg/μl de témoin interne d’amplification pour la qPCR uniplex conçue pour la quantification de l’ADN génomique du P. brassicae n’a pas diminué la sensibilité, la spécificité ni la reproductibilité de l’épreuve. Aucun des échantillons de sol inoculé de manière artificielle avec le P. brassicae ou infecté de façon naturelle ne présentait d’amplification du témoin interne. Lorsque les échantillons ont été dilués et testés de nouveau, le cycle d’amplification du témoin d’amplification a été retardé dans chaque échantillon par rapport à celui du blanc d’échantillon (eau seulement). Nous avons utilisé l’étendue du délai pour ajuster l’estimation de la concentration de spores dormantes. Les estimations corrigées des concentrations de spores étaient significativement plus élevées que les estimations non ajustées, ce qui révèle la présence d’inhibiteurs de l’ADN même dans les échantillons dilués. La seule exception a été un échantillon de sol minéral inoculé avec une faible concentration (103 spores/g) de spores dormantes. L’épreuve a été optimisée pour tout un éventail de types de sol. Des échantillons de 0,25 g de sol minéral et de 0,10 g de sol à forte teneur en matière organique se sont révélés optimums pour la récupération de l’ADN du P. brassicae. L’épreuve constitue une amélioration des épreuves existantes pour l’estimation de la concentration de spores dormantes dans les champs infectés.

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