Development and validation of an rDNA operon based primer walking strategy applicable to de novo bacterial genome finishing.

Eastman, A.W. et Yuan, Z.-C. (2015). « Development and validation of an rDNA operon based primer walking strategy applicable to de novo bacterial genome finishing. », Frontiers in Microbiology, 5(DEC: Article number 769), p. 11 pages. doi : 10.3389/fmicb.2014.00769  Accès au texte intégral (en anglais seulement)

Résumé

Les progrès dans la technologie du séquençage ont permis d’accroître considérablement la profondeur et la faisabilité du séquençage des génomes bactériens. Mais, malgré le grand nombre de génomes publiés, on en connaît encore peu sur le détail des techniques et des procédures précises employées dans leur séquençage. Les approches aléatoires (shotgun) utilisées par les plateformes de séquençage de deuxième génération ont nécessité la mise au point d’outils de bio-informatique robustes pour l’assemblage in silico, et les assemblages complets sont rares en raison des séquences d’ADN répétées et des opérons multicopies. Habituellement, il faut reséquencer avec de multiples plateformes ainsi qu’avec la méthode laborieuse du séquençage ciblé de Sanger pour compléter l’ébauche d’un génome bactérien. Nous décrivons, ici, une nouvelle stratégie fondée sur l’identification et le séquençage ciblé d’opérons d’ADNr répétitifs pour accélérer l’assemblage et le finissage du génome bactérien. Notre stratégie a été validée par le finissage du génome de la souche CR1 de Paenibacillus polymyxa, une bactérie d’intérêt dans l’agriculture durable et les procédés biologiques. L’analyse des 38 contigs contenus dans l’ébauche du génome de la souche CR1 de P. polymyxa a révélé la présence de 12 opérons répétitifs de l’ADNr avec des régions intragéniques différentes et des régions flanquantes de longueurs variées, toutes situées aux limites des contigs et dans les trous entre des contigs. Ces opérons d’ADNr fortement similaires, mais non identiques ont été confirmés expérimentalement et séquencés en même temps avec plusieurs paires d’amorces conçues spécialement à cette fin. Cette approche a aussi permis d’identifier et de corriger d’importants réarrangements de séquences qui ont eu lieu au cours de l’assemblage initial in silico des lectures de séquence. Notre approche permet de réduire les efforts associés à la marche à l’aveugle sur l’ADN pour l’assemblage des contigs et d’accroître la vitesse et la faisabilité du finissage du génome. Notre étude vient par ailleurs renforcer l’idée que les éléments répétitifs d’ADN sont des facteurs qui limitent de façon importante le finissage des génomes. Enfin, nous présentons les différentes étapes du finissage qui pourraient contribuer à de futurs projets de finissage de génomes bactériens.

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