Quantitative evaluation of bias in PCR amplification and next-generation sequencing derived from metabarcoding samples.

Pawluczyk, M., Weiss, J., Links, M.G., Aranguren, M.E., Wilkinson, M.D., et Egea-Cortines, M. (2015). « Quantitative evaluation of bias in PCR amplification and next-generation sequencing derived from metabarcoding samples. », Analytical and Bioanalytical Chemistry, 407(7), p. 1841-1848. doi : 10.1007/s00216-014-8435-y  Accès au texte intégral (en anglais seulement)

Résumé

L’identification non biaisée d’organismes par réaction PCR, après la pose d’amorces universelles et le séquençage d’ADN, repose sur l’hypothèse d’une amplification positive. Nous avons utilisé six locus universels présents dans 48 espèces végétales et nous avons quantifié le biais à chaque étape du processus d’identification, depuis la PRC en point final au séquençage de la nouvelle génération. L’amplification en point final était significativement différente pour un seul locus et entre les espèces. La PCR quantitative a révélé que le seuil de cycle de quantification pour différents locus présentait des différences d’un facteur 2000 en quantité d’ADN produite après amplification, même lors d’une seule extraction d’ADN. Les expériences de séquençage de la nouvelle génération pour neuf espèces ont révélé des biais importants envers des espèces et les locus spécifiques en utilisant des amorces spécifiques pour les adaptateurs. On peut prédire jusqu’à un certain point le biais du séquençage de la nouvelle génération à l’aide des valeurs pour les cycles de quantification de l’amplification qPCR.

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