Evaluation of viroid extraction methods and application of a one-step reverse transcription real-time polymerase cahin reaction assay (RT-qPCR) for the rapid detection of Chrysanthemum stune viroid (CSVd) infection.

Kim, W.-S., Haj-Ahmad, Y., Stobbs, L.W., et Greig, N. (2015). « Evaluation of viroid extraction methods and application of a one-step reverse transcription real-time polymerase cahin reaction assay (RT-qPCR) for the rapid detection of Chrysanthemum stune viroid (CSVd) infection. », Canadian Journal of Plant Pathology, 37(2), p. 221-229. doi : 10.1080/07060661.2015.1012742  Accès au texte intégral (en anglais seulement)

Résumé

La détection précoce des viroïdes chez les cultivars de chrysanthèmes dépend d’une méthode efficace d’extraction de l’ARN de même que d’un biotest de détection sensible. Dans cette étude, nous avons évalué des méthodes de purification de l’ARN et optimisé un biotest basé sur la RT-PCR quantitative en une étape, propre à la détection du viroïde du rabougrissement du chrysanthème (VdRC). Nous avons comparé trois techniques d’extraction de l’ARN offertes commercialement (colonnes de centrifugation avec membranes à base de carbure de silice et à base de carbure de silicium ainsi qu’extraction au phénol-chloroforme) en fonction de leur efficacité quant à la limite de détection du VdRC. Nous avons trouvé une amélioration de 10 à 50 fois de la limite de détection du VdRC lorsque nous utilisions des colonnes de centrifugation avec membranes à base de carbure de silicium (SiC) pour purifier l’ARN, comparativement aux colonnes de centrifugation avec membranes à base de carbure de silice ou à la méthode traditionnelle d’extraction au phénol-chloroforme. Afin d’optimiser la limite de détection et de réduire le temps de détection, un jeu d’amorces commercial pour PCR en point final a été adapté à un biotest basé sur la RT-PCR quantitative en une étape avec réactif SYBR Green. L’analyse de la courbe d’étalonnage a déterminé que la limite de détection était d’environ 54 copies de VdRC, et le test de spécificité réalisé sur 6 viroïdes apparentés n’a affiché aucune réactivité croisée. Dans le cadre de la validation, nous avons comparé les méthodes basées sur la RT-PCR quantitative en une étape et sur la RT-PCR pour détecter le VdRC dans des plantes cultivées en serre, sélectionnées aléatoirement, et dans des variétés de chrysanthèmes inoculés mécaniquement. Des cultivars sélectionnés dans une serre commerciale affichant des taux d’infection de plus de 50% ont été testés pour le VdRC. Les deux méthodes ont permis de le détecter chez les cultivars ‘Pelee’, ‘Puma’ et ‘Shamrock’, mais pas chez ‘Icecap’ ni ‘Snowball’. Au cours des études relatives à l’inoculation mécanique, le VdRC a été détecté chez cinq cultivars de chrysanthèmes sur six — chez ‘Chesapeake’, ‘Durango’, ‘Juneau’, ‘Pelee’ et ‘Viron’, mais pas chez ‘Pueblo’. Sur le plan de la détection, aucune différence notable n’a été décelée entre les deux méthodes.

Date de modification :