Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of a real-time TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum sporangia in the chloroform flotation fraction of sieved field soil.

Smith, D.S., Rocheleau, H.J., Rocheleau, H., Chapados, J.T., Abbott, C.L., Ribero, S., Redhead, S.A., Lévesque, C.A., et De Boer, S.H. (2013). « Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of a real-time TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum sporangia in the chloroform flotation fraction of sieved field soil. », The Western Producer, 104(4), p. 422-432. doi : 10.1094/PHYTO-05-13-0144-R  Accès au texte intégral (en anglais seulement)

Résumé

La galle verruqueuse de la pomme de terre, causée par le champignon pathogène Synchytrium endobioticum, est une maladie grave qui peut causer d’importantes pertes d’ordre économique. L’ADN ribosomique (ADNr) de la petite sous­unité (SSU) et d’un espaceur interne transcrit (ITS) a été séquencé chez diverses espèces du genre Synchytrium. Les résultats du séquençage révèlent une importante variabilité de ces deux marqueurs chez les espèces, et la monophylie de ce genre au sein du phylum des Chytridiomycota. L’espaceur intergénique non transcrit (IGS) de l’ADNr de divers pathotypes a été séquencé, et les résultats du séquençage n’ont révélé aucune variation intraspécifique chez S. endobioticum, comme dans le cas des autres marqueurs utilisés dans cette étude. Afin de faciliter le dépistage de l’agent pathogène dans le sol, trois épreuves de réaction en chaîne de la polymérase (PCR) de type TaqMan ont été conçues à partir des séquences d’ADNr liées à la SSU, à l’ITS et à l’IGS pour déceler la présence de sporanges de S. endobioticum dans la fraction chloroforme d’échantillons de sol tamisé soumis à une séparation par flottaison. Dans le volet « dépistage » de la méthode, une première PCR de type TaqMan ciblant l’ADNr de la SSU a été conçue; les résultats étaient positifs et ont été confirmés par analyse des courbes de fusion d’amplicons. Un élément synthétique cloné dans un plasmide a été incorporé à la procédure en guise de témoin de réaction, afin de faciliter la validation des résultats négatifs. La présence du témoin de réaction n’a eu aucune incidence négative sur l’efficacité de l’amplification ciblant la SSU. Une deuxième PCR de type TaqMan ciblant la région ITS-1 a été mise au point en guise d’épreuve de confirmation. Il y avait une concordance de 100 % entre la PCR de type TaqMan pour la SSU et la PCR de type TaqMan pour l’ITS-1. L’utilisation de ces deux techniques en tandem nous a permis d’obtenir une bonne spécificité pour S. endobioticum, les résultats étant négatifs avec les régions clonées de la SSU et de l’ITS-1 pour les 14 autres espèces du genre Synchytrium à l’étude. Les essais de récupération avec échantillons enrichis révèlent que ces épreuves, qui ciblent les régions de l’ADNr correspondant à la SSU et à l’ITS-1, conçues à partir d’un ensemble de données phylogénétiques correspondant au genre, pourraient déceler de manière fiable la présence d’un seul sporange dans la fraction chloroforme d’un échantillon de sol soumis à une séparation par flottaison. Une bonne corrélation entre la détection microscopique des sporanges et les résultats des PCR dans les échantillons de sol positifs et négatifs a été démontrée à la fois pour la SSU et l’ITS-1.

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