Reference Genes for RT-qPCR Analysis of Environmentally and Developmentally Regulated Gene Expression in Alfalfa.

Castonguay, Y., Michaud, J., et Dubé, M.-P. (2015). « Reference Genes for RT-qPCR Analysis of Environmentally and Developmentally Regulated Gene Expression in Alfalfa. », American Journal of Plant Sciences, 6(1), p. 132-143. doi : 10.4236/ajps.2015.61015  Accès au texte intégral (en anglais seulement)

Résumé

La RT-qPCR (PCR quantitative après transcription inverse) est une technique très précise qui est devenue la norme pour l’analyse des différences de l’expression des gènes en réaction à des traitements expérimentaux ou des différences entre des sources de gènes. Toutefois, certaines sources de variation non contrôlées peuvent avoir un effet considérable sur l’exactitude des résultats de la RT-qPCR; cette variation peut être attribuable au fait que les gènes de référence, supposément stables, sont exprimés dans diverses conditions. Dans le cadre de la présente étude, nous avons évalué la stabilité de 21 gènes de référence candidats exprimés au niveau du collet de la luzerne, chez deux cultivars (Apica et Evolution) exposés à différentes conditions environnementales (froid, stress hydrique et photopériode), ainsi qu’au niveau des parties aériennes, chez le cultivar Orca, à trois stades du développement des plantes (période végétative, pleine floraison et gousses matures). Les gènes candidats ont été sélectionnés parce qu’ils avaient déjà été identifiés chez d’autres espèces de plantes ou que leur expression était stable dans le cadre d’une hybridation différentielle de la banque d’EST préparée à partir d’ADNc provenant de luzerne non acclimatée et de luzerne acclimatée au froid. Les gènes codant l’ubiquitine ligase 2a (UBL-2a), le facteur de dépolymérisation de l’actine (ADF) et la protéine Rer1 étaient les plus stables dans l’ensemble des conditions expérimentales. Au contraire, la stabilité était faible dans le cas des gènes codant la β-actine (Act), l’α-tubuline (Tub) et la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), qui sont fréquemment utilisés comme « gènes constitutifs » dans le cadre des études sur l’expression génique. Seulement deux gènes de référence étaient nécessaires pour la normalisation des données d’expression génique pour chacune des conditions. La normalisation de l’expression des gènes d’intérêt avec celle de gènes de référence instables a mené à des observations qui entraient en conflit avec les observations effectuées au moyen des gènes de référence validés, et ces observations étaient dans certains cas incompatibles avec les connaissances actuelles au sujet du caractère. Les gènes de référence identifiés dans le cadre de la présente étude constituent de bons candidats pour la normalisation de l’expression génique de la luzerne cultivée.

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