Development of an improved RNA interference vector system for Agrobacterium-mediated plant transformation.

Toprak, U., Coutu, C., Baldwin, D., Erlandson, M.A., et Hegedus, D.D. (2014). « Development of an improved RNA interference vector system for Agrobacterium-mediated plant transformation. », Turkish Journal of Biology, 38, p. 40-47. doi : 10.3906/biy-1304-4  Accès au texte intégral (en anglais seulement)

Résumé

Chez les plantes, l’interférence par l’ARN (ARNi) offre de grandes possibilités dans la lutte contre les phytoravageurs et requiert i) le sous-clonage des régions sens/antisens dans des vecteurs compatibles; ii) le transfert de la cassette de silençage dans un vecteur binaire; iii) la transformation d’Agrobacterium tumefaciens avec les plasmides binaires voulus; et iv) la transformation des plantes avec Agrobacterium. La procédure est longue et devrait assurer la stabilité du plasmide, mais la recombinaison du plasmide due à la sélection par des antibiotiques est un problème courant. Le plasmide pGSA1252 est un vecteur binaire de silençage d’ARNi qui permet le clonage direct de structures en épingle à cheveux. Il possède toutefois un marqueur de sélection de la résistance au chloramphénicol qui donne lieu à la recombinaison du plasmide dans différentes souches d’Agrobacterium. Pour régler ce problème de compatibilité entre le marqueur de sélection et Agrobacterium{//i} et pour raccourcir le processus de clonage, nous avons mis au point un nouveau système de vecteur d’ARNi contenant la cassette d’ARNi du pGSA1252 dans le vecteur d’expression pMDC32, lequel comprend un marqueur de résistance à la kanamycine. Un promoteur de l’ARN polymérase du phage T7 a aussi été incorporé à côté du site de clonage multiple, permettant la synthèse in vitro d’ARN bicaténaire. Ce vecteur a été éprouvé dans la transformation d’Arabidopsis thaliana avec 4 constructions d’ARN bicaténaire spécifiques de gènes du mésentéron d’insectes : mucine 1 ou 4 de l’intestin des insectes, protéine 1 de la matrice péritrophique, chitine désacétylase 1 et chitine synthase-B. Ce système amélioré ne subit pas de recombinaison et raccourcit la procédure de clonage.

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