RT-PCR and Real-Time RT-PCR methods for the detection of Potato virus Y in potato leaves and tubers.

MacKenzie, T.D.B., Nie, X., et Singh, M. (2015). « RT-PCR and Real-Time RT-PCR methods for the detection of Potato virus Y in potato leaves and tubers. », Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 1236, p. 13-26. doi : 10.1007/978-1-4939-1743-3_2  Accès au texte intégral (en anglais seulement)

Résumé

Le virus PVY de la pomme de terre constitue une grave menace pour les cultures de pommes de terre partout dans le monde. Il s’agit d’un virus à ARN de la famille des Potyviridae qui comprend plusieurs souches causant toute une gamme de symptômes chez la pomme de terre. La détection par ELISA des protéines virales est couramment utilisée pour quantifier l’incidence du virus dans une culture ou un lot de semences. Mais cette technique ne permet pas détecter directement, de manière fiable, les virus dans les tubercules en dormance, ceux-ci doivent germer pendant plusieurs semaines pour produire des quantités décelables de virus. L’ELISA ne permet pas non plus de distinguer toutes les souches du virus. Plusieurs techniques ont été mises au point pour la détection directe et rapide de l’ARN viral dans les feuilles et les tubercules de la pomme de terre, lesquelles permettent également de distinguer différentes souches du virus. Nous décrivons ici plusieurs protocoles d’extraction de l’ARN des feuilles et des tubercules, de même que trois méthodes de détection fondées sur la RT-PCR (PCR précédée d’une transcription inverse). Nous présentons d’abord un protocole classique en deux étapes : transcription de l’ARN viral en ADNc, puis PCR pour amplifier le fragment d’ADNc viral. Le deuxième protocole combine la production d’ADNc et la PCR dans un seul tube et en une seule étape, ce qui réduit considérablement les coûts de matériel et de main-d’œuvre pour la détection du PVY. Le troisième protocole comprend une RT-PCR en temps réel qui permet non seulement d’économiser sur la main-d’œuvre, mais d’obtenir un titre viral plus précis. Les trois protocoles sont décrits en détail et accompagnés d’une discussion sur les avantages et les coûts relatifs de chacun, de même que sur les possibilités de modifications permettant de diminuer les coûts encore davantage. Même si ces techniques ont d’abord été élaborées pour du dépistage à grande échelle (grand nombre d’échantillons), c’est-à-dire pour déterminer l’incidence virale dans des champs commerciaux ou des lots de semences, elles peuvent aussi servir à des applications de recherche à plus petite échelle.

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