Optimization of a real-time RT-PCR assay and its comparison with ELISA, conventional RT-PCR and the grow-out test for large scale diagnosis of Potato virus Y in dormant potato tubers.

Singh, M., Singh, R.P., Fageria, M.S., Nie, X., Coffin, R.H., et Hawkins, G. (2013). « Optimization of a real-time RT-PCR assay and its comparison with ELISA, conventional RT-PCR and the grow-out test for large scale diagnosis of Potato virus Y in dormant potato tubers. », American Journal of Potato Research, 90(1), p. 43-50. doi : 10.1007/s12230-012-9274-z  Accès au texte intégral (en anglais seulement)

Résumé

Nous avons mis au point une méthode de PCR avec transcription inverse TaqMan en temps réel (RT-PCR en temps réel) et, après l’avoir optimisée, nous l’avons comparée à d’autres méthodes d’usage courant servant à détecter le virus Y de la pomme de terre (PVY) dans les tubercules de pomme de terre en dormance. Nous avons créé trois paires d’amorces et de sondes, puis nous avons déterminé si elles peuvent faciliter la détection par RT-PCR en temps réel des groupes de souches de PVY et notamment des souches PVYO, PVYN, PVYN:O (= PVYN-Wi) et PVYNTN. Sur les combinaisons d’amorces et de sondes étudiées, la combinaison PVY-1 a donné le cycle seuil (Ct) le plus bas, soit 25,75. Nous avons perfectionné notre méthode en ajustant divers paramètres, dont la concentration d’amorce et de sonde, le volume de réaction, les cycles d’amplification et les mélanges mères de différentes sources. Cette méthode de RT-PCR en temps réel a été utilisée pour la détection du PVY dans des tubercules de pomme de terre en dormance de différents cultivars et de différents champs, et les résultats ont été comparés avec ceux obtenus par RT-PCR ordinaire, par épreuve d’immunosorption enzymatique (ELISA) sur des germes et par des essais de croissance. Sur 1 069 tubercules infectés uniquement par le virus PVY, les deux formes de RT-PCR ont permis de détecter le virus dans 52 échantillons, l’ELISA sur germes, dans 45, l’ELISA sur feuilles, dans 54, et l’observation visuelle, dans 53. Toutefois, dans 61 des tubercules infectés par plusieurs virus, les deux formes de RT-PCR, de même que l’ELISA sur germes et l’ELISA sur feuilles, ont permis de détecter à peu près le même nombre d’échantillons positifs, ce qui signifie que les méthodes sont d’une même sensibilité. Étant donné que l’ELISA nécessite des tubercules qui ont germé pour la recherche du PVY, qu’avec les essais de croissance il faut attendre environ 6-8 semaines avant d’avoir des résultats et qu’avec la RT-PCR il faut faire un traitement après l’étape de la PCR, la RT-PCR en temps réel est un moyen rapide de détecter à grande échelle le PVY dans les tubercules en dormance. C’est donc la méthode à recommander pour la recherche du PVY dans les tubercules de pomme de terre à l’échelle commerciale, dans un laboratoire de diagnostic.

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