Quantitative and structural analyses of T-DNA tandem repeats in transgenic Arabidopsis SK mutant lines.

Wei, S., Xi, Y.Z., Song, D.-P., Wei, H., Gruber, M.Y., Gao, M.-J., Parkin, I.A.P., Kachatourians, G., et Hannoufa, A. (2015). « Quantitative and structural analyses of T-DNA tandem repeats in transgenic Arabidopsis SK mutant lines. », Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 123(1), p. 183-192. doi : 10.1007/s11240-015-0825-0  Accès au texte intégral (en anglais seulement)

Résumé

Chez les plantes, la transformation au moyen d’Agrobacterium donne souvent lieu à la formation de structures complexes de répétitions de l’ADN-T qui peuvent mener à la cosuppression de l’expression de gènes, voire à leur silençage. Il s’agit donc d’un effet non souhaitable chez les plantes transgéniques commerciales ou chez celles destinées à la recherche, et il faut pouvoir identifier de manière fiable ces effets dans de grandes populations de plantes transgéniques. L’utilité du transfert classique de Southern est limitée en raison de la complexité de la technique et du temps qu’il faut pour la faire. Avec ces travaux, nous avons mis au point une nouvelle méthode à débit élevé pour déterminer le nombre de copies répétées de l’ADN-T dans des de grandes populations de plantes transgéniques. Pour ce faire, nous avons amélioré la méthode de SAQPCR (standard addition quantitative PCR) à l’aide de plasmides de référence précis. Ceux-ci contenaient le gène à copie unique d’Arabidopsis codant la protéine à mobilité levée (HMG) du groupe A et soit une répétition directe de l’ADN-T ou le gène BAR de l’ADN-T. La méthode permet de déterminer rapidement et de manière fiable le nombre de répétitions complexes d’ADN-T. Les écarts entre le nombre de copies détectées par qPCR et le nombre d’insertions d’ADN-T détectées par Southern dépendent en grande partie de la complexité des répétitions d’ADN-T. Le séquençage a révélé, dans les jonctions de répétitions, des profils d’insertion similaires d’ADN-T chez les plantes transgéniques, dont une structure précise des extrémités de droite et des délétions déterminées dans les extrémités de gauche. De plus, les nucléotides de la jonction des extrémités droite et gauche de nombreuses répétitions se trouvaient à des sites immédiatement adjacents à un segment homologue des deux extrémités, laissant supposer la possibilité de recombinaison homologue dans la formation de la répétition. Nos travaux font ressortir l’utilité de cette nouvelle méthode de quantification à haut débit des répétitions en tandem d’ADN-T pour l’analyse, à grande échelle, de populations de plantes transgéniques, tout en contribuant à l’élucidation du mécanisme de formation des répétitions en tandem d’ADN-T.

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